تولید و ارزیابی آنتی بادی IgY علیه سالمونلا تیفی موریوم در سرم مرغ و تخم ورغ
مقدمه:

آلودگی مواد غذایی یکی از مشکلات بهداشتی بسیاری از کشورها بوده که هر ساله هزینه های گزافی جهت کنترل آن صرف می گردد. باکتریها نقش مهمی را در ایجاد این آلودگی عهده دار بوده که در این میان باکتری سالمونلا از اهیمت ویژه ای برخوردار می باشد و در بسیاری از کشورها این آلودگی گزارش شده است ‌‌‌‌( 1 و 2 ). باکتری سالمونلا یکی از مهمترین عوامل بیماری زای روده ای در حیوانات و انسانها بوده که از طریق آب وغذاي آلوده انتقال می یا بد ‌‌‌‌( 2 ).

جنس سالمونلا، داراي سروتیپ های متعددی بوده که می تواند باعث گاسترو آنتریت حاد (مسمومیت غذایی)، تب روده ای (تیفوئید یا پاراتیفوئید )، عفونت های سیستمیک گردد‌‌‌‌( 1 ).

آلودگی های انسانی از طریق مصرف غذاهای خام مانند گوشت، تخم مرغ و غذاهای روزانه حاصل می شود‌‌‌‌( 3 ).

سالمونلا تیفی موریوم یکی از سروتیپ هاي این باکتری می باشد که برای حیوانات آزمایشگاهی کاملاً بیماری زا بوده و پس از ورود به بدن آنها قادر است بیماری شبیه تیفوئید انسانی ایجاد نماید‌‌‌‌(3،4 ).

در سالهای اخیر، انواع مختلفی از آنتی بیوتیک ها برای مقابله با سالمونلاها استفاده شده است که با افزایش تعداد باکتری های مقاوم به آنتی بیوتیک، استفاده از روش های جایگزین ضروری به نظر مي رسد (5). استفاده از آنتی بادی های خوراکی، روش جالبی برای مقابله با پاتوژن های روده ای در انسانها و حیوانات می باشند‌‌‌‌(6،7 ). در این میان مطالعات فراوانی در خصوص تولید آنتی بادی زرده ی تخم مرغ (IgY) برای ایجاد ایمنی غیر فعال در انسان و حیوانات جهت مقابله با بسیاری از بیماری های باکتری یایی و ویروسی انجام شده است ( 8،9 10).

تولید IgY در زرده تخم مرغ از لحاظ اقتصادی بسیار مرقون به صرفه بوده و در مقایسه با IgG حجم زیادی از آنتی بادی را می توان تولید نمود بدون آنکه به حیوان آسیبی برسد ‌‌‌‌(11 ). IgY بصورت خوراکی ایمونوژن نمی باشد اما اگر بصورت داخل وریدی به موش تزریق شود یک ایمونوژن محسوب شده و سبب ایجاد پاسخ ایمنی می گردد . ‌‌‌‌IgY که بصورت خوراکی مصرف می شود در معرض دناتوره شدن توسطpH اسیدی معده و تجزیه توسط آنزیم های پروتئازی قرار می گیرد. اما مطالعات نشان داده که بخشی از آنتی بادی ها بصورت سالم باقی می مانند و بخش دیگری از آنها به قطعات2, Fc ُ Fab, Fabتجزیه می شوند. با این وجود، قطعات 2ُ Fab و Fab هنوز توانایی اتصال به آنتی ژن را حفظ نموده اند ‌‌‌‌(12 ). از دیگر مزایای این روش وجود واکنش متقاطع این آنتی بادی با باکتری های بیماری زا می باشد اما استفاده از آنتی بادی مرغی می تواند دارای معایبی از جمله امکان واکنش متقاطع با باکتری های غیر بیماری زای روده ای بوده که با ایجاد تغییر در فلور طبیعی روده ممکن است زمینه ایجاد بعضی از بیماری ها را فراهم سازد.

هدف از این تحقیق تولید و تخلیص IgY علیه سالمونلا و بررسی واکنش متقاطع آنتی بادی تولید شده علیه سالمونلا تیفی موریم با باکتری های روده ای با استفاده از روش الیزا بود.

مواد و روش کار:

سوش باکتری:

باکتری سالمونلا تیفی موریوم (ATCC= 14028) و نیز سالمونلا تیفی، باکتری شیگلا دیسانتری و اشریشیا کلی از آزمایشگاه رفرانس بیمارستان بوعلی سینا تهران تهيه گرديد. سپس با استفاده از روش های بیو شیمیایی مورد شناسایی قرار گرفتند.

آماده کردن باکتری سالمونلاتيفي موریوم برای تزریق:

به منظور آماده نمودن باکتری جهت تزریق ابتدا کشت های تازه تهیه گردید. بدین منظور باکتریها بطور جداگانه در محیط کشت BHI براث در دماي 37 درجه سانتی گراد بر روی شیکر به مدت 8 ساعت قرار داده شدند. برای غیر فعال کردن باکتریها از دمای 56 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه دربن ماری استفاده گردید.

تهیه آنتی بادی علیه سالمونلاتيفي موریوم در مرغ:

به منظور تهیه آنتی بادی در مرغ، تعداد 2 مرغ سفید لگهورن بالغ تخم گذار تهيه گرديد. به هر کدام از مرغ ها تعداد CFU 107 باکتری تزریق شد. پس از غير فعال كردن باكتري ها به روش فوق، با استفاده از سانترفيوژ به مدت 10 دقیقه وبا دور rpm 3000 نسبت به جداسازي باكتري ها اقدام گرديد. سپس سلولها با آب مقطر استريل شستشو داده شدند و در نهايت حجم سلولها با آب مقطر استریل به 250 میکرولیتر رسانده شد. 250 ميكروليتر ادجوانت کامل با نمونه آماده مخلوط و پس از تهيه سوسپانسيون از آن به عضله ی سینه دو مرغ سفید تخم گذار تزریق گردید. از سرم و تخم مرغ دو مرغ سفید لگهورن بالغ تخم گذار که آنتی ژن دریافت نکرده بودند به عنوان شاهد استفاده شد.

به منظور افزایش تیتر آنتی بادی، تعداد CFU 107باکتری مورد نظر همراه با ادجوانت ناقص (به روش فوق تهیه شدند) در 3 نوبت دیگر با فاصله ی زمانی هر دو هفته یک بار به مرغ های مورد نظر تزریق شدند. تزریق پنجم یک ماه پس از تزریق چهارم وبدون ادجوانت انجام گردید. قبل از انجام هر تزریق، از رگ زير بال هر مرغ ها خون گیری به عمل آمد. برای جدا سازی سرم، خونِ هر مرغ بطور جداگانه به داخل اپندورف استريل منتقل شده و به مدت 10 دقیقه با دور rpm 3000 سانترفیوژ شدند. مایع رویی که حاوی سرم بود جمع آوری و در دمای منهاي 4 درجه سانتی گراد تا انجام آزمایش نگهداری شد.

تخلیص IgY و تعيين ميزان پروتئين:

به منظور تخلیص IgY، ‌‌‌‌پس از تزریق سوم آنتی ژن به مرغ های مورد آزمایش، نسبت به جمع آوری تخم مرغ های حاوی آنتی بادی اقدام ودر دماي 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. به منظور تخلیص IgY، 10 میلی لیتر از زرده تخم مرغ که بطوركامل از سفیده جدا و به آن 100 میلی لیتر كلرو فرم سرد (منهای 20 درجه ی سانتی گراد) اضافه گردید. پس از تشکیل دوفاز، فاز زیرین را دور ریخته و این مرحله دوباره تکرار شد. پس از آن به فاز رویی ایزوپروپانول سرد اضافه گردید. در این مرحله فاز رویی را دور ریخته، رسوب جمع آوری و به آن استون سرد افزوده، آن را در کاغذ صافی پخش کرده تا کاملاَ خشک شود. آنگاه به آن50 میلی لیتر PBS افزوده و یک ساعت در دمای محیط ( در حالیکه مرتباً توسط مگنت بهم می خورد ) قرار داده شد. در مرحله ی بعد نمونه را در rpm12000 سانتر فیوژ و محلول رویي كه حاوی IgY بوده است جداسازي گرديد.

از روش براد فورد براي تعيين ميزان پروتئين استفاده شده است.

تست الیزا:

برای بررسی تيتر آنتي بادي توليد شده عليه سالمونلا تيفي موريوم و نیزانجام تست متقاطع از تست الیزا استفاده شد. جهت انجام آزمایش 4 عدد پلیت الیزا انتخاب شد. بدين منظور ابتدا هر چاهك از ميكروپليت تعداد CFU 104 از باکتری سالمونلا تيفي موريوم که توسط حرارت غیر فعال شده به همراه 100 میکرو لیتر از كوتينگ بافر ( بافر کربنات – بی کربنات 05/0 مولار با 6 /9 pH= ) پوشانده و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد بر روی شیکر قرار داده شدند. به منظور كنترل اجزاي واكنش الایزا، یک ردیف از این پليت ها به عنوان شاهد انتخاب گرديد.

پس از زمان فوق، ميكروپليت سه دفعه با بافر PBST (PBS با 4/7 = pH حاوي 05/0 درصدتوئين 20 ) شستشو داده شد. سپس چاهك هاي ميكروپليت با 100 ميكروليتر بافر PBSTG (PBST حاوي 2درصد ژلاتين) بلاك گرديد و ميكروپليت در دمای 37 درجه سانتي گراد به مدت يك ساعت قرار گرفت. پس از شستشو ميكروپليت، سرم مرغ ويا زرده تخم مرغ در چاهك‌هاي مربوطه در بافرPBST در حجم 100 ميكروليتر تهيه و ريخته شد و مجدداً ميكرو پليت به مدت يك ساعت در دمای37 درجه سانتي گراد قرارداده شد. پس از شستشو، 100ميكروليتر از كانژوگه (antiIgY) در رقت3000/1 اضافه و در دماي 37 درجه سانتي گراد به مدت يك ساعت قرار گرفت. در نهايت به دنبال شستشو، 100 ميكروليتر از محلول سوبسترا به چاهك اضافه شد و اجازه داده شد تا واكنش طي مدت 20 دقيقه كامل شود. واكنش با اسيد سولفوريك1 مولار متوقف و جذب درطول موج 490 نانومتر به كمك دستگاه الايزا ريدر خوانده شد.

الکترو فورزSDS-PAGE:

با استفاده از روش Laemli الكتروفورز سديم دودسيل سولفات پلي آكريل آميد ژل الكتروفورز انجام شد و از ژل 10 درصد استفاده گرديد. به منظور انجام الکترو فورز، IgY تخلیص شده از زرده تخم مرغ به مدت 5 دقیقه در بافر نمونه بدون 2ME جوشانده شدند. همچنين براي بررسي بيشتر، يك نمونه از IgY تخليص شده از زرده تخم مرغ به همراه بافر نمونه داراي 2MEاستفاده شد. الكتروفورز بوسيله ژل 10 درصد و در شدت جريان 14 ميلي آمپر انجام گردید و پس از اتمام الکتروفورز، ژل باکوماسی بلورنگ آمیزی شد.

يافته ها:

پس از شناسايي باكتري با استفاده از روش هاي بیوشيميايي نسبت به تولید آنتی بادی در مرغ اقدام گردید، نمودار 1 تیتر IgY تولید شده علیه باکتری سالمونلا تیفی موریوم در سرم مرغ را نشان می دهد. در این نمودار افزایش میزان IgY پس از تزریقات آنتی ژن تهیه شده در نوبت سوم، چهارم و پنجم مشخص مي باشد. بیشترین تیتر آنتی بادی پس از تزریق نوبت پنجم مشاهده گردید. از سرم مرغ های تخم گذار که آنتی ژن دریافت نکرده بودند به عنوان شاهد استفاده شد. نمودار 2 مقايسه تيتر آنتي بادي توليد شده عليه سالمونلا تيفي موريوم در سرم، تخم مرغ تخليص شده بوسيله حلال هاي آلي و تخم مرغ تخليص نشده را نشان مي دهد. میزان آنتی بادی IgY در سرم بیش از میزان آن در زرده تخم مرغ تخلیص نشده بود. این درحالی است که با تخلیص این آنتی بادی میزان آن در نمونه افزایش یافت (نمودار 2). از زرده تخم مرغ های تهیه شده از مرغ های تخم گذاری که آنتی ژن دریافت نکرده بودند به عنوان شاهد استفاده گردید. ميزان پروتئين سنجيده شده در تخم مرغ تخليص شده به روش براد فورد برابر با 11 ميلي گرم در ميلي ليتر بود. نمودار 3 تست تقاطع ميان سرم ضد سالمونلا تيفي موريوم باكتري هاي سالمونلا تيفي، شيگلا واشريشياكلي را نشان مي دهد. در صد شباهت بدست آمده از بررسی واکنش متقاطع بين سرم ضد سالمونلا تيفي موریوم و باكتري سالمونلا تيفي بیشترین میزان را نشان داد که 63 درصد بود این در حالی است که کمترین میزان واکنش متقاطع بین این آنتی بادی با باکتری اشريشياكلي به میزان 14 درصد می رسید. در این میان واکنش متقاطع بین باکتری شيگلا دیسانتری با آنتی بادی تولید شده، 25 درصد مشاهده شد.

به منظور بررسی آنتی بادی توليد شده در سرم و تخم مرغ و تخلیص آن، از ژل الكتروفورز 10 درصد استفاده شد. با استفاده از SDS-PAGE نشان داده شد که تخلیص آنتی بادی IgY با استفاده از روش استفاده شده مطلوب بود. (تصوير 1)ستون 1 مربوط به آنتي بادي تخليص شده از تخم مرغ(توسط حلال آلي) با استفاده از بافر نمونه بدون 2ME مي باشد. ستون 2 نشان دهنده باند مربوط به آنتي بادي تخليص شده از سرم مرغ با استفاده از بافر نمونه بدون 2ME است. باند هايي با وزن مولكولي تقريباًً 180 كيلو دالتون در اين دو ستون مربوط به IgY تخليص شده از تخم مرغ مي باشد. ستون 3آنتي بادي تخليص شده از سرم مرغ با استفاده از بافر نمونه داراي 2ME مي باشد. باندهاي 50 و 25كيلو دالتوني به ترتيب مربوط به زنجيره سنگين و زنجيره سبك آنتي بادي مي باشند. ستون 4 ماركر پروتئيني مي باشد.

بحث:

حضور آنتي بادي IgY در خون و تخم مرغ قابل رديابي است. توليد IgYدر زردة تخم مرغ روش اقتصادي و مؤثر براي افزايش آنتي بادي هاي پلي كلونال مي باشند. به طور مثال يك مرغ تخم گذار مي تواند آنتي بادي معادل با 90 – 75 ميلي ليتر از سرم يا 180 – 150 ميلي ليتر از كل خون را در طي يك هفته در زردة تخم مرغ توليد كند. در حاليكه از خرگوش تقريباً در هر هفته 20 ميلي ليتر خون گيري مي شود. فقط پستانداران بزرگتر مثل گاو و اسب مي توانند آنتي بادي هاي بيشتر از مرغ توليد كنند‌‌‌‌( 12 ). خواص ضد باكتريايي IgY يكي از مهمترين جنبه هاي مطالعه IgY است. بسياري از گزارشات نشان ميدهد كه IgY مي تواند داراي عملكرد ايمني زايي در عفونت هاي باكتريايي و ویروسی در موجودات زنده باشند (10 و 13). در سال 1994 Peralta و همكارانش از IgY توليد شده عليه سالمونلا انتريتيديس براي جلوگيري از سالمونلوزيس در موش ها به صورت خوراكي استفاده كردند. این نتايج نشان داد كه IgY مي تواند نقش مهمي در ايمني زايي داشته باشد‌‌‌‌(14 ). در سال 1997 Hatta و همكارانش از IgY توليد شده عليه استرپتوكوكوس موتانس در جهت جلوگيري از ايجاد پلاك دنداني استفاده كردند. كه سبب كاهش استقرار اين باكتري در دندان شده است‌‌‌‌(15). علاوه بر استفاده از IgY عليه بيماري هاي باكتريايي، اين آنتي بادي عليه بيماري ويروسي نيز استفاده شده است. در سال 1993 Kuroki و همكارانش از IgY توليده شده عليه روتا ويروس در مدل موش استفاده كردند كه سبب كاهش اسهال در آنها شد‌‌‌‌(9 ).

Beal و همکارانش (2004) نشان دادند که پس از تزریق مجدد باکتری سالمونلا میزان آنتی بادی اختصاصی IgY بشدت افزایش می یابد‌‌‌‌(16 ). Clifton-Hadley و همکارانش (2002) و Woodward و همکارانش (2002) گزارش کردند که پس از تزریق باکتری کشته شده سالمونلا تیفی موریوم، مقدار قابل توجه آنتی بادی IgY تولید گردید ‌‌‌‌(17 و 18) در این تحقیق نیز از باکتری کشته شده جهت تحریک سیستم ایمنی استفاده گردید تا میزان قابل قبولی آنتی بادی تولید گردد. تولید آنتی بادی پس از تزریق اولین دوز باکتری آغاز شد و پس از تزریق بوستر افزایش یافت که با نتایج بدست آمده از تحقیق Beal و همکارانش مطابقت دارد هر چند حداکثر آنتی بادی تولید شده پس از تزریق بوستر چهارم اتفاق افتاد و تا هفته دوازدهم ادامه یافت(16 ).

در این تحقیق نشان داده شد که آنتی بادی تولید شده علیه باکتری سالمونلا تیفی موریوم دارای واکنش متقاطع با باکتری سالمونلا تیفی بود (63%) این در حالی بود که این آنتی بادی با باکتری شیگلا دیسانتری 25% و با باکتری اشریشیا کلی 14 % واکنش متقاطع داشت که با یافته Lee و همکارنش (2002) که نشان داده اند آنتی بادی تولید شده در مرغ علیه سالمونلا انتریتیدیس دارای 3/55% واکنش متقاطع با سالمونلا تیفی موریوم داشته و در مقابل، مقدار کمتری واکنش متقاطع با باکتری اشریشیا کلی دارد تطابق دارد ‌‌‌‌(19 ). این واکنش متقاطع زیاد بین آنتی بادی تولید شده علیه سالمونلا تیفی موریوم با باکتری سالمونلا تیفی و مقایسه آن با باکتری شیگلا دیسانتری 25% و با باکتری اشریشیا کلی این حقیقت را که گونه های مختلف سالمونلا دارای آنتی ژن سوماتیک و نیز اپی توپ های مشترک بر روی فلاژلین هستند بیان می کند. واکنش متقاطع با باکتری های بیماری زا از مزایای نسبی کاربرد این آنتی بادی می باشد اما واکنش متقاطع با باکتری های غیر بیماری زای روده ای ممکن است منجر به تغییر فلور طبیعی روده شده و زمینه ایجاد بعضی از بیماری ها را فراهم سازد.

در این مطالعه میزان تولید آنتی بادی در سرم و زرده تخم مرغ مورد بررسی قرار گرفت. مقدار آنتی بادی در سرم بیش از مقدار آن در زرده تخم مرغ بود که ابتدا میزان آنتی بادی در سرم افزایش یافته و سپس در تخم مرغ این افزایش مشاهده می شود. روند افزایش آنتی بادی در سرم وبه دنبال آن در زرده تخم مرغ توسط sunwoo (1996) قبلا گزارش شده بود و نتایج بدست آمده را مورد تایید قرار می دهد ‌‌‌‌(20 ).

IgY کاملاً به حرارت مقاوم است و فعالیت ایمونولوژیکی آن تحت تاثیر پاستوریزاسیون كاهش نمي يابد‌‌‌‌(21 ). تفاوت فيلوژنتيكي زيادي بين گونه پستانداران و پرندگان وجود دارد. اين اختلاف تكاملي سبب مي شود آنتي بادي مرغي در مقايسه با آنتي بادي هاي پستانداران به اپي توپ هاي بيشتري بر روي پروتئين هاي پستانداران متصل شود. در نتيجه آنتی بادی های مرغي دارای حساسیت بالایی می باشند بطوری که تحقیقات نشان می دهد آنتی بادی مرغي 5-3 برابر بیشتر از آنتی بادی خوک به IgG خرگوش متصل می شود(21 و 22).

نتيجه گيري:
سیستم ایمنی مرغ نسبت به آنتی ژن سالمونلا عکس العمل نشان داده و آنتی بادی تولید نمود. نظر به اینکه این آنتی بادی در تخم مرغ تولید می شود و عموما مردم از تخم مرغ استفاده می کنند و با توجه به نتایج این تحقیق و یافته دیگر محققین و علی رغم وجود واکنش متقاطع این آنتی بادی با باکتری های روده ای، این آنتی بادی به عنوان منبع ایمنی غیر فعال در بیماری سالمونلوز پس از بررسی کامل مورد استفاده قرار گیرد.